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 近年來,隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展以及ELISA試劑盒檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用,對(duì)雙歧桿菌的鑒定和檢測(cè)已從傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法發(fā)展到應(yīng)用以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的各種酶免疫檢測(cè)方法。在所有以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法中,酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是目前發(fā)展zui為迅速并且較為完善的檢測(cè)方法。
 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,根據(jù)酶反應(yīng)底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于利用了酶的率催化反應(yīng),間接放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定具有*的靈敏度。而且,ELISA檢測(cè)是在微量板中進(jìn)行的,可以對(duì)大量樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),節(jié)省了時(shí)間。ELISA法中的雙抗體夾心方法是常用來檢測(cè)抗原的方法。目前所報(bào)道的相關(guān)研究中,都未能對(duì)利用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)雙歧桿菌的反應(yīng)條件進(jìn)行建立并且沒有對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行定量檢測(cè)的研究。ELISA方法克服了傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的繁瑣及分子生物學(xué)檢測(cè)方法的費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn),如能開發(fā)出其檢測(cè)雙歧桿菌的試劑盒將對(duì)實(shí)際應(yīng)用將具有重要意義。
 故此,建立本課題展開這方面的研究。 本課題中,自制并獲得了價(jià)免疫血清;建立并優(yōu)化了雙抗夾心ELISA檢測(cè)雙歧桿菌的方法;用建立起的ELISA法組裝試劑盒,對(duì)試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),非雙歧桿菌屬微生物對(duì)本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無影響,重復(fù)性良好,對(duì)雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL（g）;檢測(cè)時(shí)間為4h;用此試劑盒檢測(cè)市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進(jìn)行檢測(cè)時(shí),與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)方法相比,兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著（p0.05）;用此試劑盒對(duì)自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品（1）進(jìn)行檢測(cè)時(shí),與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)方法相比,兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果差異顯著（p0.05）。
 ELISA試劑盒具體研究結(jié)果如下: 
1.免疫血清的制備 制備出的兔抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清效價(jià)可達(dá)1:20480;鼠抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清效價(jià)達(dá)1:10240,均具有較高的效價(jià)。
2.雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)雙歧桿菌zui適反應(yīng)條件的建立 通過對(duì)雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法中各反應(yīng)條件進(jìn)行摸索和比較,確定*反應(yīng)條件為:*包被抗體和二抗反應(yīng)濃度分別為1:160和1:5120;選用NBS和1%BSA-PBS分別作為包被緩沖液和封閉緩沖液;封閉30min;酶標(biāo)抗體作1:2000的稀釋之后作用90min;zui后底物反應(yīng)時(shí)間為20min;并且繪制了此方法檢測(cè)雙歧桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.4461x-2.1503,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9881。
3. ELISA試劑盒的組裝 試劑盒主要組分有:兔抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清包被并封閉的8×12孔酶標(biāo)板;工作濃度鼠抗長(zhǎng)雙歧桿菌免疫血清;工作濃度酶標(biāo)抗體;長(zhǎng)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)品;底物溶液;終止液;濃縮洗滌液;操作方法及說明。 
4.試劑盒的方法學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)所組建的雙抗夾心ELISA檢測(cè)雙歧桿菌的試劑盒進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià),包括:特異性、重復(fù)性、靈敏度。對(duì)分別含有4種不同雙歧桿菌和七種不含雙歧桿菌的樣品進(jìn)行檢測(cè),非雙歧桿菌屬微生物對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響,說明此方法具有較強(qiáng)的特異性;用五種不同樣品對(duì)板間及板內(nèi)分別做了重復(fù)性實(shí)驗(yàn),僅有很好的幾分樣品變異系數(shù)超過10%,說明此試劑盒具有良好的重復(fù)性;對(duì)雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL; 
5.試劑盒的保存期實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)包被酶標(biāo)板的保質(zhì)期進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)證明,此試劑盒能在4℃的條件下保存一年以上; 6.試劑盒在雙歧桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用 采用所組建的雙歧桿菌雙抗夾心ELISA試劑盒對(duì)市售雙歧桿菌的酸奶、奶粉及自制雙歧桿菌乳粉進(jìn)行檢測(cè)與平板計(jì)數(shù)法相比。用此試劑盒檢測(cè)市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進(jìn)行檢測(cè)時(shí),與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)方法相比,兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著（p0.05）;用此試劑盒對(duì)自制含雙歧桿菌的乳粉產(chǎn)品（1）進(jìn)行檢測(cè)時(shí),與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)方法相比,兩種ELISA試劑盒檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果差異顯著（p0.05）。